Please send your spontaneous applications to the respective team leaders or thematic leaders.
PROPOSITION DE DOCTORAT :
1: Evaluation biologique de ligands et de protéines interagissant avec l'ADN en i-motifs
PROPOSITIONS DE STAGE DE MASTER 2:
1 : Evaluation biologique de ligands de l’ADN en i-Motif
DOCTORAT :
1: Evaluation biologique de ligands et de protéines interagissant avec l'ADN en i-motifs
Référence de l'offre : CF202121580
Doctorat : Doctorat complet
Biologie Santé : Ile-de-France
Disciplines : Pharmacologie, Biologie Cellulaire, Biochimie
Laboratoire : STRUCTURE ET INSTABILITÉ DES GÉNOMES, UMR 7196, Inserm U1154
Institution d'accueil : MUSEUM PARIS
Ecole doctorale : Sciences de la Nature et de l'Homme : évolution et écologie - ED 227
Description
Les structures secondaires non usuelles des acides nucléiques (G-quadruplexes, R-loops,…) ont été décrites in vitro depuis plusieurs décennies et de nombreux travaux ont permis d’identifier leur importance cellulaire dans les mécanismes de régulation du métabolisme des acides nucléiques. Ces avancées ont été possibles grâce à la mise au point d’outils biomoléculaires (ligands spécifiques, anticorps,…) et à l’étude des protéines interagissant avec ces structures dans différents organismes modèles. Les structures G-quadruplexes, découvertes initialement aux télomères, sont essentielles dans le contrôle de l’activité transcriptionnelle des gènes et de l’épissage des ARN messagers, pour ne citer que quelques exemples. Les i-motifs, qui correspondent à des structures d’ADN à quatre-brins riches en cytosines dans lesquelles des cytosines sont intercalées grâce à des paires de bases C-C hémi-protonées, peuvent se former théoriquement au niveau des séquences génomiques complémentaires à celles des G-quadruplexes. Les i-motifs ont été principalement étudiés in vitro, en raison de leur formation à pH acide, mais des travaux récents montrent que la dépendance au pH n’est pas aussi stricte et que des i-motifs peuvent se former dans le noyau de cellules humaines. Contrairement aux G-quadruplexes, peu de molécules sont connues pour interagir de façon sélective avec l’i-motif in vitro et leurs effets intracellulaires sont mal connus.
Le projet de thèse dans le domaine de la pharmacologie cellulaire et moléculaire porte sur la caractérisation et la compréhension des fonctions biologiques des i-motifs comparativement aux G-quadruplexes, en utilisant des ligands spécifiques capables de moduler la stabilité de ces structures et en étudiant les protéines interagissant avec les i-motifs par des techniques de pull-down dans le cadre du projet ANR iCARE.
Envoyer CV et références, ainsi que relevé de note de Master à : Jean-François RIOU, responsable de l’équipe SANTé, riou@mnhn.fr
Compétences requises : Compétences en biologie cellulaire et moléculaire: culture cellulaire, cytométrie de flux, immunofluorescence...
Mots clés : G-quaduplexes, i-motifs, ligands de l'ADN, dommages de l'ADN, criblage moléculaire, protéome
Type de financement : ANR, Contrat Doctoral, durée 36 mois
Date de démarrage : Dès que possible
Bibliographie
- Chatain J, Hatem G, Delagoutte E, Riou JF, Alberti P, Saintomé C. Multiple hPOT1-TPP1 cooperatively unfold contiguous telomeric G-quadruplexes proceeding from 3' toward 5', a feature due to a 3’-end binding preference and to structuring of telomeric DNA. 2021 Nucleic Acids Res, Aug 21 in press.
- Pipier A, Devaux A, Lavergne T, Adrait A, Couté Y, Britton S, Calsou P, Riou JF, Defrancq E, Gomez D. Constrained G4 structures unveil topology specificity of known and new G4 binding proteins. Sci Rep. 2021 Jun 29;11(1):13469.
- Bossaert M, Pipier A, Riou JF, Noirot C, Nguyên LT, Serre RF, Bouchez O, Defrancq E, Calsou P, Britton S, Gomez D. Transcription-associated topoisomerase2α (TOP2A) activity is a major effector of cytotoxicity induced by G-quadruplex ligands. Elife. 2021 Jun 28;10:e65184.
- Noiret A, Puch L, Riffaud C, Costantini D, Riou JF, Aujard F, Terrien J. Sex-Specific Response to Caloric Restriction After Reproductive Investment in Microcebus murinus: An Integrative Approach. Front Physiol. 2020 Jun16;11:506.
- Le Berre G, Hossard V, Riou JF, Guieysse-Peugeot AL. AP-TSS: A New Method for the Analysis of RNA Expression from Particular and Challenging Transcription Start Sites. Biomolecules. 2020 May 28;10(6):827.
- Le Berre G, Hossard V, Riou JF, Guieysse-Peugeot AL. Repression of TERRA Expression by Subtelomeric DNA Methylation Is Dependent on NRF1 Binding. Int J Mol Sci. 2019 Jun 7;20(11):2791.
- Hwang IP, Mailliet P, Hossard V, Riou JF, Bugaut A, Roger L. Investigating the Effect of Mono- and Dimeric 360A G-Quadruplex Ligands on Telomere Stability by Single Telomere Length Analysis (STELA). Molecules. 2019 Feb 6;24(3):577.
- Saintomé C , Alberti P , Guinot N , Lejault P , Chatain J , Mailliet P , Riou JF , Bugaut A . Binding properties of mono- and dimeric pyridine dicarboxamide ligands to human telomeric higher-order G-quadruplex structures. Chem Commun (Camb). 2018 Feb 15;54(15):1897-1900.
- Lancrey A, Safa L, Chatain J, Delagoutte E, Riou JF, Alberti P, Saintomé C. The binding efficiency of RPA to telomeric G-strands folded into contiguous G-quadruplexes is independent of the number of G4 units. Biochimie. 2018 Mar;146:68-72.
- Terrien J, Gaudubois M, Champeval D, Zaninotto V, Roger L, Riou JF, Aujard F. Metabolic and genomic adaptations to winter fattening in a primate species, the grey mouse lemur (Microcebus murinus). Int J Obes (Lond). 2018 Feb;42(2):221-230.
- Hussain T, Saha D, Purohit G, Kar A, Kishore Mukherjee A, Sharma S, Sengupta S, Dhapola P, Maji B, Vedagopuram S, Horikoshi NT, Horikoshi N, Pandita RK, Bhattacharya S, Bajaj A, Riou JF, Pandita TK, Chowdhury S. Transcription regulation of CDKN1A (p21/CIP1/WAF1) by TRF2 is epigenetically controlled through the REST repressor complex. Sci Rep. 2017 Sep 14;7(1):11541.
- Safa L, Gueddouda NM, Thiébaut F, Delagoutte E, Petruseva I, Lavrik O, Mendoza O, Bourdoncle A, Alberti P, Riou JF, Saintomé C. 5' to 3' Unfolding Directionality of DNA Secondary Structures by Replication Protein A: G-QUADRUPLEXES AND DUPLEXES. J Biol Chem. 2016 Sep 30;291(40):21246-21256.
MASTERS
1/ Evaluation biologique de ligands de l’ADN en i-Motif
Les structures secondaires non usuelles des acides nucléiques (G-quadruplexes, R-loops,…) ont été décrites in vitro depuis plusieurs décennies et de nombreux travaux ont permis d’identifier leur importance cellulaire dans les mécanismes de régulation du métabolisme des acides nucléiques. Ces avancées ont été possibles grâce à la mise au point d’outils biomoléculaires (ligands spécifiques, anticorps,…) et à l’étude des protéines interagissant avec ces structures dans différents organismes modèles. Les structures G-quadruplexes, découvertes initialement aux télomères, sont essentielles dans le contrôle de l’activité transcriptionnelle des gènes et de l’épissage des ARN messagers, pour ne citer que quelques exemples. Les i-motifs, qui correspondent à des structures d’ADN à quatre-brins riches en cytosines dans lesquelles des cytosines sont intercalées grâce à des paires de bases C-C hémi-protonées, peuvent se former théoriquement au niveau des séquences génomiques complémentaires à celles des G-quadruplexes. Les i-motifs ont été principalement étudiés in vitro, en raison de leur formation à pH acide, mais des travaux récents montrent que la dépendance au pH n’est pas aussi stricte et que des i-motifs peuvent se former dans le noyau de cellules humaines. Contrairement aux G-quadruplexes, peu de molécules sont connues pour interagir de façon sélective avec l’i-motif in vitro et leurs effets intracellulaires sont mal connus.
Notre projet de recherche porte sur caractérisation et la compréhension des fonctions biologiques des i-motifs comparativement aux G-quadruplexes, en utilisant des ligands spécifiques comme outils capables de moduler la stabilité de ces structures.
L’objectif du stage de Master est de caractériser l’activité cellulaire de plusieurs dérivés décrits dans la littérature comme ligands de i-motifs et de nouvelles molécules synthétisées en collaboration avec des équipes de chimistes. L’effet du pH intracellulaire, du cycle cellulaire, du prétraitement par des ligands G4 seront étudiés à l’aide de plusieurs lignées cellulaires humaines en culture sur la formation de cassures double-brins de l’ADN et des i-motifs intracellulaires.
Les techniques abordées seront principalement la culture cellulaire, la cytométrie de flux, l’immunofluorescence et la biologie moléculaire.
Références:
Mergny JL & Sen D. Chem Rev 2019, 119: 6290-6325
Sedghi Masoud S & Nagazawa K. Chem Pharm Bull 2018, 66: 1091-1103
Varshney D et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2020, 21: 459-474
Zeraati M et al. Nat Chem 2018, 10: 631-637
Laboratoire:
Structure et Instabilité des Génomes CNRS UMR 7156-INSERM 1154
Muséum National d’Histoire Naturelle – 43 rue Cuvier 75005 Paris.
Directeur Jean-Baptiste Boulé
Équipe d’accueil:
SANTÉ - Structure des Acides Nucléiques, Télomères et Evolution
Responsable de l’Équipe : Jean-François Riou
Responsables de l’encadrement : Jean-François Riou – Virginie Hossard
jean-francois.riou[at]mnhn.fr, virginie.hossard[at]mnhn.fr
2/ Etude de l'interaction entre ADN télomérique et protéines de liaison à l'ADN simple-brin par des approches in vitro
Les télomères sont des séquences d’ADN, associées à des protéines, localisées aux extrémités des chromosomes. L’ADN télomérique est constitué́ d’une région double brin, dont le «brin G», riche en guanines consécutives, se prolonge du côté 3’ en une région simple brin, ce qui lui vaut l’appellation de G- overhang. Les guanines consécutives sur le brin G peuvent former des structures d’ADN à quatre brins nommées G-quadruplexes (G4). Ces structures doivent être déroulées au cours du cycle cellulaire pour permettre la bonne réplication de l'ADN télomérique et le maintien des télomères.
Au sein de l’équipe nous nous intéressons à deux protéines de liaison à l'ADN simple brin (SSB) présentes aux télomères et jouant un rôle important dans le maintien des télomères: la Protéine de Réplication A (RPA) et la Protéine de Protection des télomères (POT1), toutes deux capables de dérouler les G4 in vitro. Nous avons caractérisé in vitro la liaison (affinité, mode de liaison, mécanisme d'ouverture des G4) de ces protéines humaines avec l'ADN télomérique et plus particulièrement avec de longues séquences télomériques structurées en G4 multiples, essentiellement par gel retard et spectroscopie de fluorescence (Transfert d'énergie par résonance de fluorescence).
Le stage de master 2 s’inscrira dans la continuité du projet de l'équipe et aura pour but d'étudier la structure de ces complexes ADN-protéine par des approches biochimiques et biophysiques. La compréhension des mécanismes et des structures mises en jeu dans les interactions ADN télomérique-SSB, permettra de mieux comprendre le rôle de ces SSB dans le maintien des télomères.
Les techniques abordées seront principalement la purification de protéines recombinantes, électrophorèses et spectroscopie UV et de fluorescence.
Publications:
Chatain J, Blond A, Phan AT, Saintomé C, Alberti P. GGGCTA repeats can fold into hairpins poorly unfolded by Replication Protein A: a possible origin of the length-dependent instability of GGGCTA variant repeats in human telomeres. Nucleic Acids Res., accepted 2021 June 2
Lancrey A, Safa L, Chatain J, Delagoutte E, Riou JF, Alberti P, Saintomé C. The binding efficiency of RPA to telomeric G-strands folded into contiguous G-quadruplexes is independent of the number of G4 units. Biochimie. 2018; 146:68-72. doi: 10.1016/j.biochi.2017.11.017.
Saintomé C, Alberti P, Guinot N , Lejault P , Chatain J , Mailliet P , Riou JF , Bugaut A. Binding properties of mono- and dimeric pyridine dicarboxamide ligands to human telomeric higher-order G-quadruplex structures. Chem Commun (Camb). 2018; 54:1897-1900. doi: 10.1039/c7cc07048a.
Safa L, Gueddouda NM, Thiébaut F, Delagoutte E, Petruseva I, Lavrik O, Mendoza O, Bourdoncle A, Alberti P, Riou JF, Saintomé C. 5' to 3' Unfolding Directionality of DNA Secondary Structures by Replication Protein A: G-quadruplexes and duplexes. J Biol Chem. 2016; 291:21246-56. doi: 10.1074/jbc.M115.709667
Laboratoire:
Structure et Instabilité des Génomes CNRS UMR 7156-INSERM 1154
Muséum National d’Histoire Naturelle – 43 rue Cuvier 75005 Paris.
Directeur Jean-Baptiste Boulé
Équipe d’accueil:
SANTÉ - Structure des Acides Nucléiques, Télomères et Evolution
Responsable de l’Équipe : Jean-François Riou
Responsables de l’encadrement : Patrizia Alberti et Carole Saintomé
patrizia.alberti[at]mnhn.fr, carole.saintome[at]mnhn.fr
Résumé du projet :
Des molécules-chimères, appelées PROTACs, comprenant un ligand ou un inhibiteur d’une protéine-cible couplé à un ligand d’une ligase E3 capable de polyubiquinyler la protéine cible et ainsi d’induire sa dégradation au protéasome sont apparues il y a une vingtaine d’années. Cette approche désormais classique en thérapeutique humaine a récemment abouti à de premiers composés en clinique1.
Des concepts voisins consistant à concevoir des oligonucléotides conjugués à des ligands de ligase E3 viennent juste d’émerger. Le premier « TRAFTAC » consiste à utiliser un oligonucléotide double brin représentant la séquence de fixation à l’ADN d’un facteur de transcription pour induire la dégradation sélective de ce dernier avec comme premier exemple NF-kB2. Le second « RNA-PROTAC » utilise un oligo-ARN mimant le site de liaison d’une protéine liant l’ARN pour induire sa dégradation, avec comme premier exemple la protéine Lin28 impliquée dans certains cancers.
Le projet « ssDNA-PROTAC » (single strand DNA-PROTAC), proche de ces deux derniers exemples, s’intègre dans les thématiques de l’équipe et de l’unité. Il consiste à préparer des chimères comprenant un oligo-ADN correspondant au site de fixation d’une protéine se fixant à de l’ADN simple brin et un ligand de ligase E3 dans le but d’induire la dégradation spécifique de cette protéine et d’en étudier les effets cellulaires, notamment pour la protéine hPOT1 qui se lie à l’extrémité simple brin des télomères.
Pour ce projet, nous utiliserons le pomalidomide, ligand de Céréblon, et un ligand VHL de la proteine Von-Hippel Lindau. Ces ligands seront couplés, sur résine, à des bras de liaisons de longueur variable, de type polyéthylèneglycol PEG dans un premier temps, en nous inspirant de la méthode de Krajcovicoca4 ; puis un groupe alcyne sera introduit à l’extrémité des bras de liaison. Des oligo-ADN commerciaux, porteurs eux d’un groupe azide terminal seront ensuite couplés à l’ensemble “ligand E3-linker » par chimie Click pour fournir les « ssDNA-PROTACs » souhaités.
L’étude de faisabilité chimique sera réalisée avec un oligo-ADN polyT, puis le travail sera étendu à l’oligo-ADN décamère correspondant au site de fixation de la protéine hPOT1. Le concept pourra ensuite être étendu à d’autres protéines intéragissant avec le simple brin télomérique dans le but de mieux préciser la biologie des télomères.
1 pour revue: M.J. Bond & C.M.Crews. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) come on age: entering the third decade of targeted protein degradation. RSC Chemical Biology 2(3):725-742 (2021).
2 K.T.G. Samarasinghe et al. Targeted degradation of transcription factors by TRAFTACs: TRAnscription Factor TArgeting Chimeras. Cell Chemical Biology 28, 648-661 (2021).
3 A. Ghidini et al. RNA-PROTACs: Degraders of RNA-binding proteins. Angewandte Chemie 60(6), 3163-69 (2021).
4 S. Krajcovicova et al. Solid-phase synthesis for thalidomide-based proteolysis-targeting chimeras (PROTAC). Chemical Communications 55(7):929-932 (2019).
Equipe d’Accueil :Structure des Acides Nucléiques, Télomères et Évolution
Intitulé de l’Unité : Structure et Instabilité des Génomes
Nom du Responsable de l’Unité : Jean-Baptiste BOULÉ
Nom du Responsable de l’Équipe : Jean-François RIOU
Adresse : Muséum National d’Histoire Naturelle- 43, rue Cuvier, 75005 Paris
Responsable de l’encadrement : Gildas MOUTA CARDOSO et Jian-Sheng SUN
Tél : 01 40 79 36 96
Personnes à contacter : mouta[at]mnhn.fr ou sun[at]mnhn.fr ou mailliet[at]mnhn.fr
Ce projet s’inscrit-il dans la perspective d’une thèse :
oui x
non o