Veuillez adresser vos  candidatures spontanées aux responsables d'équipes ou porteurs de thématiques respectifs.

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Propositions de stage de Master 2:

          1 : Etude de l'interaction entre ADN télomérique et protéines de liaison à l'ADN simple-brin par des approches in vitro

          2 : Projet ssDNA-PROTAC

1/  Etude de l'interaction entre ADN télomérique et protéines de liaison à l'ADN simple-brin par des approches in vitro

Les télomères sont des séquences d’ADN, associées à des protéines, localisées aux extrémités des chromosomes. L’ADN télomérique est constitué́ d’une région double brin, dont le «brin G», riche en guanines consécutives, se prolonge du côté 3’ en une région simple brin, ce qui lui vaut l’appellation de G- overhang. Les guanines consécutives sur le brin G peuvent former des structures d’ADN à quatre brins nommées G-quadruplexes (G4). Ces structures doivent être déroulées au cours du cycle cellulaire pour permettre la bonne réplication de l'ADN télomérique et le maintien des télomères.

Au sein de l’équipe nous nous intéressons à deux protéines de liaison à l'ADN simple brin (SSB) présentes aux télomères et jouant un rôle important dans le maintien des télomères: la Protéine de Réplication A (RPA) et la Protéine de Protection des télomères (POT1), toutes deux capables de dérouler les G4 in vitro. Nous avons caractérisé in vitro la liaison (affinité, mode de liaison, mécanisme d'ouverture des G4) de ces protéines humaines avec l'ADN télomérique et plus particulièrement avec de longues séquences télomériques structurées en G4 multiples, essentiellement par gel retard et spectroscopie de fluorescence (Transfert d'énergie par résonance de fluorescence).

Le stage de master 2 s’inscrira dans la continuité du projet de l'équipe et aura pour but d'étudier la structure de ces complexes ADN-protéine par des approches biochimiques et biophysiques. La compréhension des mécanismes et des structures mises en jeu dans les interactions ADN télomérique-SSB, permettra de mieux comprendre le rôle de ces SSB dans le maintien des télomères.

Les techniques abordées seront principalement la purification de protéines recombinantes, électrophorèses et spectroscopie UV et de fluorescence.

Publications:

Chatain J, Blond A, Phan AT, Saintomé C, Alberti P. GGGCTA repeats can fold into hairpins poorly unfolded by Replication Protein A: a possible origin of the length-dependent instability of GGGCTA variant repeats in human telomeres. Nucleic Acids Res., accepted 2021 June 2

 Lancrey A, Safa L, Chatain J, Delagoutte E, Riou JF, Alberti P, Saintomé C. The binding efficiency of RPA to telomeric G-strands folded into contiguous G-quadruplexes is independent of the number of G4 units. Biochimie. 2018; 146:68-72. doi: 10.1016/j.biochi.2017.11.017.

Saintomé C, Alberti P, Guinot N , Lejault P , Chatain J , Mailliet P , Riou JF , Bugaut A. Binding properties of mono- and dimeric pyridine dicarboxamide ligands to human telomeric higher-order G-quadruplex structures. Chem Commun (Camb). 2018; 54:1897-1900. doi: 10.1039/c7cc07048a.

Safa L, Gueddouda NM, Thiébaut F, Delagoutte E, Petruseva I, Lavrik O, Mendoza O, Bourdoncle A, Alberti P, Riou JF, Saintomé C. 5' to 3' Unfolding Directionality of DNA Secondary Structures by Replication Protein A: G-quadruplexes and duplexes. J Biol Chem. 2016; 291:21246-56. doi: 10.1074/jbc.M115.709667

Laboratoire:

Structure et Instabilité des Génomes CNRS UMR 7156-INSERM 1154

Muséum National d’Histoire Naturelle – 43 rue Cuvier 75005 Paris.

Directeur Jean-Baptiste Boulé

Équipe d’accueil:

SANTÉ - Structure des Acides Nucléiques, Télomères et Evolution

Responsable de l’Équipe : Jean-François Riou

Responsables de l’encadrement : Patrizia Alberti et Carole Saintomépatrizia.alberti[at]mnhn.fr, carole.saintome[at]mnhn.fr

2. Projet ssDNA-PROTAC

Résumé du projet :

Des molécules-chimères, appelées PROTACs, comprenant un ligand ou un inhibiteur d’une protéine-cible couplé à un ligand d’une ligase E3 capable de polyubiquinyler la protéine cible et ainsi d’induire sa dégradation au protéasome sont apparues il y a une vingtaine d’années. Cette approche désormais classique en thérapeutique humaine a récemment abouti à de premiers composés en clinique¹.  

Des concepts voisins consistant à concevoir des oligonucléotides conjugués à des ligands de ligase E3 viennent juste d’émerger. Le premier « TRAFTAC » consiste à utiliser un oligonucléotide double brin représentant la séquence de fixation à l’ADN d’un facteur de transcription pour induire la dégradation sélective de ce dernier avec comme premier exemple NF-kB². Le second « RNA-PROTAC » utilise un oligo-ARN mimant le site de liaison d’une protéine liant l’ARN pour induire sa dégradation, avec comme premier exemple la protéine Lin28 impliquée dans certains cancers.

Le projet « ssDNA-PROTAC » (single strand DNA-PROTAC), proche de ces deux derniers exemples, s’intègre dans les thématiques de l’équipe et de l’unité. Il consiste à préparer des chimères comprenant un oligo-ADN correspondant au site de fixation d’une protéine se fixant à de l’ADN simple brin et un ligand de ligase E3 dans le but d’induire la dégradation spécifique de cette protéine et d’en étudier les effets cellulaires, notamment pour la protéine hPOT1 qui se lie à l’extrémité simple brin des télomères.

Pour ce projet, nous utiliserons le pomalidomide, ligand de Céréblon, et un ligand VHL de la proteine Von-Hippel Lindau. Ces ligands seront couplés, sur résine, à des bras de liaisons de longueur variable, de type polyéthylèneglycol PEG dans un premier temps, en nous inspirant de la méthode de Krajcovicoca⁴ ; puis un groupe alcyne sera introduit à l’extrémité des bras de liaison.  Des oligo-ADN commerciaux, porteurs eux d’un groupe azide terminal seront ensuite couplés à l’ensemble “ligand E3-linker » par chimie Click pour fournir les « ssDNA-PROTACs » souhaités.

L’étude de faisabilité chimique sera réalisée avec un oligo-ADN polyT, puis le travail sera étendu à l’oligo-ADN décamère correspondant au site de fixation de la protéine hPOT1. Le concept pourra ensuite être étendu à d’autres protéines intéragissant avec le simple brin télomérique dans le but de mieux préciser la biologie des télomères.

¹ pour revue: M.J. Bond & C.M.Crews. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) come on age: entering the third decade of targeted protein degradation. RSC Chemical Biology 2(3):725-742 (2021).

² K.T.G. Samarasinghe et al. Targeted degradation of transcription factors by TRAFTACs: TRAnscription Factor TArgeting Chimeras. Cell Chemical Biology 28, 648-661 (2021).

³ A. Ghidini et al. RNA-PROTACs: Degraders of RNA-binding proteins. Angewandte Chemie 60(6), 3163-69 (2021).

⁴ S. Krajcovicova et al. Solid-phase synthesis for thalidomide-based proteolysis-targeting chimeras (PROTAC). Chemical Communications 55(7):929-932 (2019).

Equipe d’Accueil :Structure des Acides Nucléiques, Télomères et Évolution

Intitulé de l’Unité : Structure et Instabilité des Génomes

Nom du Responsable de l’Unité : Jean-Baptiste BOULÉ

Nom du Responsable de l’Équipe : Jean-François RIOU

Adresse : Muséum National d’Histoire Naturelle- 43, rue Cuvier, 75005 Paris

Responsable de l’encadrement : Gildas MOUTA CARDOSO et Jian-Sheng SUN

Tél : 01 40 79 36 96              

Personnes à contacter :  mouta[at]mnhn.fr ou sun[at]mnhn.fr ou mailliet[at]mnhn.fr

Ce projet s’inscrit-il dans la perspective d’une thèse :

                                                       oui  x

                                                       non o