Les cellules eucaryotes ont développé diverses voies de réparation pour résoudre les dommages à l’ADN et la réparation fidèle est cruciale pour maintenir l’intégrité du génome. L’édition du génome avec des nucléases spécifiques de séquences, telles que le système CRISPR/Cas9, tire parti de ces voies pour produire des changements génétiques permanents et constitue maintenant une stratégie majeure pour étudier l’organisation du génome et la fonction des gènes, créer des modèles animaux de maladie et améliorer la thérapie génique.

Notre équipe s’intéresse à l’étude des voies de réparation des cassures double-brin d’ADN, de leurs rôles dans l’édition du génome ainsi que dans différents contextes biologiques, en tirant parti des nouvelles possibilités permises par les nucléases à façon.

Nos projets s’orientent autour de trois grands axes :

• L’amélioration des stratégies précises d’édition du génome par la modulation des voies de réparation de l’ADN
• L’étude du mécanisme de réparation de jonction des extrémités médiée par microhomologie (MMEJ) et de ses fonctions
• La caractérisation de l’adaptation des mécanismes de réparation de l’ADN aux conditions environnementales extrêmes chez les tardigrades

Membres de l'Equipe :

• Carine Giovannangeli, DR CNRS
• Jean-Paul Concordet, CR Inserm
• Danièle Praseuth, MC Museum
• Laureline Roger, MC Museum
• Anne De Cian, IR Inserm
• Charlotte Boix, AI Inserm
• Alice Brion, IE Museum
• Khadija Lamribet, IE Inserm
• Marie As, CDD IE Inserm
• Mathieu Carrara, Doctorant (Co-direction G. Pezeron UMR 7221, MNHN)
• Marwan Anoud, Doctorant

Anciens membres de l'équipe:

• Fatemeh Rabbani, Doctorante (Université Tarbiat Modares, Téhéran, Iran)
• Loïc Perrouault, IE Museum
• Ahmed Kheder, PhD student
• Sylvain Geny, Post-Doc
• Erika Brunet, CR Inserm
• Loelia Babin, Doctorante
• Sonia Dubois, Post-Doctorante
• Jean-Baptiste-Renaud, IE-CDD
• Marine Charpentier, Doctorante
• Armêl Millet, Doctorante

Amélioration des stratégies précises d’édition du génome par la modulation des voies de réparation de l’ADN

L’édition du génome, en introduisant d’abord une lésion ciblée, s’appuie sur la capacité de la cellule à résoudre les cassures double-brin (CDB) de l’ADN pour générer une modification du génome. Le but ultime de l’édition du génome est de produire efficacement une édition précise mais cela reste difficile dans de nombreux systèmes biologiques, y compris ceux cliniquement pertinents.

En effet, parmi les voies de réparation CDB, le « Non-Homologous End-Joining » canonique (cNHEJ) et les voies alternatives de  « End-joining » (altEJ) telles que la jonction des extrémités médiée par micro-homologie (MMEJ) sont généralement efficaces mais aboutissent à des résultats divers; en revanche, la réparation dépendante de l’homologie (HDR) qui est impliquée si un ADN de donneur homologue est fourni comme modèle de réparation, en plus de la nucléase, peut générer des modifications précises mais est souvent inefficace. Un objectif central de notre équipe est d’augmenter l’efficacité de l’édition précise du génome dans différents contextes expérimentaux et de mieux comprendre et contrôler les mécanismes de réparation CDB impliqués.

Ces dernières années, nous avons développé des outils d’édition du génome et les avons utilisés avec succès pour optimiser les invalidations de gènes dans divers systèmes biologiques, y compris divers modèles animaux pour des études fonctionnelles ^(1,2,3) et des cellules humaines pour des approches de thérapie génique ⁽⁴⁾. Cette expertise a maintenant été transférée au service TACGENE. Nous travaillons également sur des améliorations de l’intégration de séquence suite à l’induction de CDB avec des nucléases à façon, principalement en exploitant et en manipulant les voies de réparation CDB ^{(5,6,7,8,9, 15)}.

Figure 1 : Programmed sequence modifications with CRISPR-Cas9 systems

Crédits

©C-Giovannangeli

Mécanismes et fonctions de la réparation des cassures double-brin (CDB) :

En utilisant des méthodes d’édition du génome pour imiter certains réarrangements génomiques, nous avons réussi à élucider les voies de réparation CDB impliquées dans les délétions de l’ADN mitochondrial ⁽¹⁰⁾ et dans les translocations chromosomiques ⁽¹¹⁾ et à caractériser les réponses cellulaires associées ⁽¹²⁾. Nous avons également développé une analyse biochimique de complexes de réparation DSB reconstitués et fonctionnels in vitro et identifié le protéome des extrémités d’ADN par spectrométrie de masse semi-quantitative ⁽¹³⁾.

Nos projets en cours se concentrent sur des mécanismes alternatifs de jonction des extrémités (Alt-EJ). Parmi les voies de réparation pour les cassures double-brin (CDB), une voie alternative appelée MMEJ, pour jonction des extrémités médiée par micro-homologie, semble jouer un rôle prédominant dans la réparation des CDB induites par les nucléases artificielles ⁽¹⁴⁾ et s’avère essentielle pour certaines fonctions physiologiques, telles que la réparation des cassures double-brin au cours de l’embryogenèse. Cette réparation est caractérisée par une résection révélant de courtes séquences flanquant la rupture, appelées micro-homologies, et le recrutement de l’ADN polymérase θ. Afin d’approfondir les connaissances actuelles sur la voie MMEJ, nous souhaitons caractériser davantage les composants, la régulation et les fonctions physiologiques du MMEJ, en étudiant son rôle dans la réparation des DSB sur des loci génomiques spécifiques et dans des organismes modèles.

Figure 2 : DSB repair pathways choice

Crédits

©L.Roger

Adaptation des mécanismes de réparation de l’ADN aux conditions environnementales extrêmes chez les tardigrades

Nous avons choisi d’étendre nos activités de recherches sur la réparation de l’ADN aux tardigrades, un nouvel organisme modèle in vivo pour la tolérance aux environnements extrêmes.

Les tardigrades sont résistants à une grande variété d’environnements difficiles, y compris des conditions qui induisent des niveaux élevés de dommages à l’ADN. L’étude des tardigrades peut donc ouvrir la voie à l’identification de nouvelles protéines et voies qui prennent en charge les dommages de l’ADN. Nous proposons de caractériser les bases moléculaires de la tolérance du génome tardigrade par l’identification et l’analyse des gènes candidats des voies de réparation de l’ADN chez différentes espèces de tardigrades, en utilisant des approches de génomiques fonctionnelles et comparatives.

Figure 3: Hypsibius exemplaris tardigrade with oocytes and embryos at various cell stages (DIC and Dapi staining)

Crédits

©A.De-Cian

Principales collaborations:

• Maximilian Haeussler, University of California at Santa Cruz (CRISPOR website)
• Bernard Lopez, Institut Cochin/CNRS-Inserm, Paris (DNA repair)
• Anna Buj-Bello/Mario Amendola, Genethon/Inserm, Evry (gene therapy)
• Annarita Miccio, Imagine/Inserm-CNRS, paris
• Tsuyoshi Momose, SU-CNRS, Villefranche s/ Mer (Genome editing and repair in Clitya jellyfish)
• Arnaud Poterszman, IGBMC/CNRS-Inserm, Strasbourg (NER repair)
• Jean-Michel Itier, Sanofi, Vitry (genome editing in iPS cells)
• Antoine Coulon, Institut Curie/CNRS-Inserm (DNA imaging with CRISPR)
• Ignacio Anegon, TRIP/Inserm, Nantes (Genome editing improvement in rat)
• Filippo Del Bene, Institut de la Vision/Inserm, Paris (Genome editing improvement in zebrafish)
• Erika Brunet, Imagine/Inserm-CNRS, Paris (Chromosomal translocations)
• Hervé Tostivint, Guillaume Pezeron, MNHN/CNRS (Genome editing and MMEJ in zebrafish)
• Saman Hosseinkhani, Tarbiat Modares University, Iran (Apoptosome reporter cells)
• Roberto Guidetti, University of Modena, Italie (tardigrade biology)

Références sélectionnées:

1. Haeussler M., Schönig K., Eckert H., Eschstruth A., Mianné J., Renaud J-B., Schneider-Maunoury S., Shkumatava A., Teboul L., Kent J., Joly J-S. & Concordet J-P. (2016) Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17(1):148.

2. Di Donato V., De Santis F., Auer T-O., Testa N., Sánchez-Iranzo H., Mercader N., Concordet J-P. & Del Bene F. (2016) 2C-Cas9: a versatile tool for clonal analysis of gene function. Genome Res. 26,5:681-92.

3. Auer, T-O., Duroure, K., Concordet, J-P. & Del Bene, F. (2014) CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nat Protoc. 9,12: 2823-40.

4. Weber L., Frati G., Felix T., Hardouin G., Casini A., Wollenschlaeger C., Meneghini V., Masson C., De Cian A., Chalumeau A., Mavilio F., Amendola M., Andre-Schmutz I., Cereseto A., El Nemer W., Concordet, J.-P., Giovannangeli, C., Cavazzana, M. & Miccio, A. (2020) Editing a γ-globin repressor binding site restores fetal hemoglobin synthesis and corrects the sickle cell disease phenotype. Sci Adv. 2020 Feb 12;6(7):eaay9392. doi: 10.1126/sciadv.aay9392.

5. Renaud J-B., Boix C., Charpentier M., De Cian A., Cochennec J., Duvernois-Berthet E., Perrouault L., Tesson L., Edouard J., Thinard R., Cherifi Y., Menoret S., Fontanière S., de Crozé N., Fraichard A., Sohm F., Anegon I., Concordet J-P. & Giovannangeli C. (2016) Improved Genome Editing Efficiency and Flexibility Using Modified Oligonucleotides with TALEN and CRISPR-Cas9 Nucleases. Cell Reports. 14,9:2263-72.

6. Ménoret, S., De Cian, A., Tesson, L., Remy, S., Usal, C., Boulé, J-B., Boix, C., Fontanière, S., Crénéguy, A., Nguyen, T-H., Brusselle, L., Thinard, R., Gauguier, D., Concordet, J-P., Cherifi, Y., Fraichard, A., Giovannangeli, C. & Anegon, I.  (2015) Homology-directed repair in rodent zygotes using Cas9 and TALEN engineered proteins. Sci Rep. 7(5):14410. 

7. Rémy, S., Tesson, L., Ménoret, S., Usal, C., De Cian, A., Thepenier, V., Thinard, R., Baron, D., Charpentier, M., Renaud, J-B., Buelow, R., Cost, G-J., Giovannangeli, C., Fraichard, A., Concordet, J-P. & Anegon, I. (2014) Efficient gene targeting by homology-directed repair in rat zygotes using TALE nucleases. Genome Res. 24,8: 1371-83.

8. Charpentier M., Khedher A.H.Y., Menoret S., Brion A., Lamribet K., Dardillac E., Boix C., Perrouault L., Tesson L., Geny S., De Cian A., Itier J.-M., Anegon I., Lopez B., Giovannangeli C. & Concordet J.-P. (2018) CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair. Nat Commun. 9, 1133. 

9. Elaheh Sadat Hosseini, Maryam Nikkhah, Amir Ali Hamidieh, Howard O Fearnhead, Jean-Paul Concordet, and Saman Hosseinkhani (2020)Lumiptosome, an Engineered Luminescent Form of Apoptosome Reports Cell Death Through the Same Apaf-1 Dependent Pathway. J Cell Sci, 133(10):jcs242636.  doi:10.1242/jcs.242636.

10. Phillips A-F., Millet A-R., Tigano M., Dubois S-M., Crimmins H., Babin L., Charpentier M., Piganeau M., Brunet E &, Sfeir A. (2017)Single-Molecule Analysis of mtDNA Replication Uncovers the Basis of the Common Deletion. Mol Cell. 65(3):527-538 e526.

11. Ghezraoui, H., Piganeau, M., Renouf, B., Renaud, J-B., Sallmyr, A., Ruis, B., Oh, S., Tomkinson, A-E., Hendrickson, E-A., Giovannangeli, C., Jasin, M. & Brunet, E. (2014) Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Mol Cell. 55, 6: 829-42.

12. Babin L, Piganeau M, Renouf B, Lamribet K, Thirant C, Deriano L, Mercher T, Giovannangeli C & Brunet EC. (2018) Chromosomal Translocation Formation Is Sufficient to Produce Fusion Circular RNAs Specific to Patient Tumor Cells. iScience. 2018 Jul 27;5:19-29. doi: 10.1016/j.isci.2018.06.007.

13. Berthelot V., Mouta-Cardoso G., Hégarat N., Guillonneau F., François J-C., Giovannangeli C., Praseuth D. & Rusconi F. (2016) The human DNA ends proteome uncovers an unexpected entanglement of functional pathways. Nucleic Acids Res. 44,10:4721-33.

14. Momose T, De Cian A, Shiba K, Inaba K, Giovannangeli C & Concordet J-P. (2018) High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.Sci Rep. 2018 Aug 6;8(1):11734. doi: 10.1038/s41598-018-30188-0.

15. Geny S, Pichard S, Brion A, Renaud JB, Jacquemin S, Concordet JP, Poterszman A. Tagging Proteins with Fluorescent Reporters Using the CRISPR/Cas9 System and Double-Stranded DNA Donors. Methods Mol Biol. 2021;2247:39-57. doi: 10.1007/978-1-0716-1126-5_3.